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COSA SI STA FACENDO:

I) PARTECIPAZIONE AL PROGETTO  DI RICERCA “DISCOver: Difetti dello Sviluppo Corticale: conoscere per curare”

Istituto G. Gaslini, Università di Genova
Dott. Federico Zara, dott. Pasquale Striano

PREMESSA

Le malformazioni dello sviluppo corticale (MSC) indicano un ampio spettro di anomalie strutturali che interessano la parte esterna del cervello definita corteccia cerebrale. Tali difetti si generano nel corso dell’embriogenesi a causa di alterazioni genetiche o di insulti intercorrenti nel corso della gravidanza o in epoca perinatale. Le MSC sono responsabili di epilessia e di disturbi neurologici e cognitivi di gravità variabile, in relazione all’ area cerebrale coinvolta e alla estensione della malformazione.

La classificazione attuale si basa sullo stadio a cui il processo di sviluppo viene perturbato e sui meccanismi biologici implicati e, laddove non siano disponibili informazioni più accurate, su specifiche caratteristiche neuroradiologiche. Tra le diverse forme ricordiamo la Sclerosi Tuberosa, la Lissencefalia, la Polimicrogiria, l’Emimegalencefalia.

I recenti sviluppi della genetica hanno dimostrato che numerosi geni sono implicati nelle MSC. Le correlazioni tra le diverse forme e i geni implicati sono complesse e dipendono dallo specifico impatto delle mutazioni nelle diverse fasi dello sviluppo cerebrale.

Tuttavia le cause genetiche rimangono ignote per un consistente numero di bambini con MSC. Ci sono ampie evidenze che i fattori genetici alla base della malformazioni corticali siano molteplici e che ci sia ancora molto da scoprire.

 

RAZIONALE E OBIETTIVI DEL PROGETTO DISCOver

Il progetto DISCOver si base sul presupposto che per curare o, meglio prevenire, sia necessario conoscere le alterazioni genetiche che modificano il “programma” fisiologico di sviluppo della corteccia cerebrale per poter intervenire in maniera mirata. Infatti le terapie riabilitative e farmacologiche possono nello scenario più ottimistico mitigare i sintomi poiché non dirette a modificare le cause alla base della patologia.

In questo contesto è nato il progetto DISCOver che si propone di studiare le basi genetiche dei difetti dello sviluppo corticale e esplorare approcci innovativi di medicina personalizzata.

 FASI DEL PROGETTO

Il progetto si è sviluppato in diverse fasi:

FASE 1: DIAGNOSI MOLECOLARE E PREVENZIONE

Obiettivo della prima fase è stato quello di sviluppare test diagnostici per la diagnosi molecolare precoce di MSC. Tale attività ha consentito di attivare e implementare nell’ ambito del Sistema Sanitario Nazionale, presso l’Istituto G. Gaslini di Genova, tre diversi test genetici di nuova generazione.

Tali test si basano sul sequenziamento del DNA ad alta processività e consentono di identificare mutazioni nel DNA in parallelo in numerosi geni il cui ruolo nelle MSC è comprovato.

I test genetici sviluppati sono: Test per le Malformazioni dello Sviluppo Cerebrale (56 geni)  (vedi sotto, paragrafo “COSA E’ GIÀ STATO REALIZZATO GRAZIE ALLA NOSTRA ASSOCIAZIONE”), Test per la Sclerosi Tuberosa (2 geni), Test per la ricerca di mutazioni somatiche nei geni del pathway dell’MTOR (8 geni).

I testi sono oggi pienamente usufruibili in maniera gratuita per tutti i pazienti del territorio nazionale e sono stati ad oggi utilizzati da più di 100 famiglie. Laddove è stata raggiunta una diagnosi è stato possibile offrire una consulenza genetica mirata e la possibilità di eseguire test molecolari prenatali mirati per la pianificazione familiare e la prevenzione.

FASE 2: IDENTIFICAZIONE DI NUOVI GENI PER LE MSC

35 casi negativi ai test genetici sono stati sottoposti ad uno studio di ricerca avanzato per l’individuazione di mutazioni in geni non ancora associati a MSC attraverso il sequenziamento dell’ “esoma”, cioè di tutti i 20.000 geni codificanti proteine nell’uomo. I dati di questo studio sono ancora in fase di rielaborazione e i risultati saranno disponibili nel corso del 2018.

Nel corso del 2018 saranno sottoposto all’esoma un ulteriore coorte di 20 casi. I dati genetici della coorte di 55 casi verranno analizzati in parallelo e confrontati con i dati di progetti internazionali quali Epi25K per l’identificazione di nuovi geni responsabili di MSC.

FASE 3: SVILUPPO DI TERAPIE INNOVATIVE PER LA CURA PERSONALIZZATA

La fase 3 del progetto è stata attivata nel 2018 ed è l’ultima fase prevista dal progetto DISCOver. L’obiettivo è quello di sviluppare approcci terapeutici innovativi mediante le nuove biotecnologie.

La numerosità dei geni coinvolti nelle MSC e la complessità dei meccanismi fisiologici implicati rappresentano un ostacolo importante verso lo sviluppo di un approccio unificante. In questo contesto abbiamo scelto di esplorare la tecnologia delle sonde molecolari a RNA per l’attivazione dei geni colpiti da mutazioni che ne determinano una perdita funzionale. Tali sonde consentono  di aumentare la produzione di proteina da parte di del gene “sano” laddove la mutazione genetica colpisce una sola delle due copie geniche, condizione che si riscontra in diverse MSC. Allo stato attuale abbiamo iniziato a produrre sonde molecolari per i geni TSC1 e TSC2 per la sclerosi tuberosa, la forma più comune di difetto di sviluppo corticale.

Le risorse che si renderanno disponibili per il progetto DISCOver verranno utilizzate per la fase 3 del progetto

 

 

II) PROGETTO DI RICERCA SCIENTIFICA “ENEA ONLUS” – RESPONSABILI DOTT. FEDERICO ZARA E DR. PASQUALE STRIANO

Istituto G. Gaslini, Università di Genova

La malformazioni cerebrali risultanti da difetti congeniti dello sviluppo del cervello sono frequentemente associate ad epilessia, disturbi cognitivi ed altri sintomi neurologici. Le malformazioni strutturali sono estremamente eterogenee e riflettono una varietà di processi patologici. Studi recenti hanno evidenziato che numerose forme hanno un’origine genetica. Tuttavia per una consistente parte di pazienti le cause genetiche rimangono inspiegabili. Il presente studio si propone di scoprire nuovi geni responsabili di malformazioni cerebrali ed epilessia. Tale obiettivo verrà perseguito attraverso l’utilizzo delle più innovative tecnologie di genomica che consentono il sequenziamento del genoma in tempi rapidi e a basso costo. A tale scopo è stato messo a punto un nuovo test genetico che, oltre ai geni responsabili di polimicrogiria, analizza e studia altre importanti malformazioni corticali (vedi articolo a seguire).

In particolare il progetto si propone di sequenziale l’esoma (cioè la parte funzionale di genoma che codifica per proteine) in una serie di soggetti affetti da malformazioni corticali ed epilessia e i loro genitori. Per ogni soggetto verrà determinato il profilo delle varianti e verrà eseguito un confronto con le varianti polimorfiche distribuite nella popolazione generale. Varianti dell’esoma assenti nella popolazioni generale verranno considerate quali mutazioni putative. Le mutazioni putative verranno quindi priorizzate in relazione alla insorgenza de novo (assenti nei genitori) e allo stato di omozigosi (entrambe le copie geniche affette dalla stessa mutazione) o eterozigosi composta (due mutazioni diverse nello stesso gene).

I geni nei quali verranno identificate nuove mutazioni saranno testati successivamente mediante screening di mutazione su una coorte più ampia di pazienti al fine di confermarne l’eventuale eziopatogenicità e /o di stabilire le correlazione genotipo/ fenotipo.

Al fine di mettere a punto il sistema di analisi si è eseguito e completato lo studio pilota su una prima famiglia composta da probando e genitori e l’intento è ora di estendere lo studio ad una più ampia coorte di pazienti. 

COSA E’ GIÀ STATO REALIZZATO GRAZIE ALLA NOSTRA ASSOCIAZIONE:

TEST GENETICO PER MALFORMAZIONI CORTICALI MEDIANTE SEQUENZIAMENTO DI NUOVA GENERAZIONE

Il test “Pannello Genetico per le Malformazioni dello Sviluppo Corticale ed Epilessia” viene eseguito su raccomandazione medica in base a specifiche indicazioni cliniche e subordinato all’ ottenimento di un consenso scritto da parte del probando, genitore o tutore. In generale il test viene eseguito nel caso in cui la storia clinica e le indagini strumentali e di laboratorio non evidenzino un’eziologia di tipo acquisito e suggeriscano la presenza di malformazioni dello sviluppo corticale di origine genetica.  Le malformazioni dovute a un’anomalia dello sviluppo corticale (MSC) indicano un ampio spettro di malformazioni cerebrali costituite durante l’embriogenesi. Esse sono responsabili di epilessia e di disturbi neurologici e cognitivi di intensità variabile, in relazione con lo stadio di comparsa dei disturbi e con l’estensione della malformazione. La classificazione attuale si basa sullo stadio a cui il processo di sviluppo viene perturbato, sui pathway biologici implicati e, laddove non siano disponibili informazioni più accurate, su specifiche caratteristiche neuroradiologiche. (omissis)

I recenti sviluppi della genetica hanno mostrato che numerosi geni sono implicati in diversi tipi di malformazioni corticali e sindromi malformative cerebrali complesse a causa dello specifico impatto funzionale delle mutazioni nelle diverse fasi dello sviluppo cerebrale. In questo contesto non è spesso possibile correlare inequivocabilmente mutazioni in specifiche geni a distinte condizioni malformative. Tuttavia è possibile individuare alcuni grandi raggruppamenti clinici all’interno dei quali riconoscere significative correlazioni genotipo-fenotipo: 1) Megalencefalie;  2) Malformazioni corticali tipo “Cobblestone”;  3) Lissencefalie;  4) Polimicrogirie;      5) Eterotopie nodulari;   6) Eterotopie a bande sottocorticali;  7) Displasie corticali focali.

Per alcune sindromi malformative, quali ad esempio le Schizencefalie, non sono note associazioni genetiche significative.

(omissis)

IL TEST E’ COSì ORGANIZZATO:

–  Screening mutazionale dei seguenti 56 geni: ATP6V0A2, B3GALNT2, POMGNT2, POMGNT1, FKRP, FKTN, B3GNT1, ISPD, LAMB1, POMK, LARGE, POMT1, POMT2, TMEM5, ACTB, ACTG1, RELN, VLDLR, PAFAH1B1, DYNC1H1, KIF5C, TUBA1A, TUBB, TUBB2B, WDR62, LAMC3, SNAP29, GMPPB, COL18A1, NDE1, KIAA1279, NSDHL, OCLN, PAX6, RAB3GAP1, RAB3GAP2, RAB18, TBC1D20, RTTN, TUBA8, TUBB3, LAMA2, GPR56, SRPX2, GPSM2, ARFGEF2, DCHS1, EML1, ERMARD, FAT4, FLNA, MEF2C, TUBG1, KIF2A, DCX, CNTNAP2.

–  Il test di screening utilizza le  nuove tecniche di sequenziamento, chiamate “next-generation sequencing”, che consentono l’analisi di numerosi geni in un unico saggio. Il test di screening ha una sensibilità complessiva pari a circa il 90%, variabile tra l’80% ed il 95% a seconda dei geni.

–        Per i geni in cui il test ha sensibilità inferiore al 95% è possibile richiedere il completamento diagnostico mediante sequenziamento tradizionale con metodica Sanger.

Il test genetico e’ stato sviluppato specificamente per identificare mutazioni costitutive in geni più comunemente implicati nelle Malformazioni Corticali allo stato attuale delle conoscenze.

Alcuni geni riportati in letteratura quali responsabili di Malformazioni Corticali non sono stati inclusi nella attuale versione del test, per i seguenti motivi:

– ARX. Il gene contiene sequenze ad elevato contenuto GC, non amplificabile medianti metodiche standard. Il sequenziamento NGS non copra circa il 40% del gene.

– Le Megalencefalie possono essere associate a mutazioni somatiche nei geni AKT3 e PIK3CA. L’identificazione di mutazioni somatiche presenti a bassa percentuale nelle cellule del sangue periferico deve essere perseguita mediante specifici approcci sperimentali differenti da quelli in uso per lo studio di mutazioni germinali. A tal fine i geni per la Megalencefalie sono stati esclusi nel presente test genetico mirato all’identificazione di mutazioni costitutive.

– Sono stati inoltre esclusi geni specificamente associate a entità sindromi che complesse chiaramente riconoscibili sul piano clinico ed in cui la malformazione corticale rappresenta un reperto accessuale (ad esempio CHD7 per la Sindrome CHARGE).

Le Malformazioni Corticali sono oggetto di intensa ricerca scientifica. E’ possibile che in futuro il test venga ulteriormente sviluppato nel caso emergessero nuove acquisizioni. Al fine di interpretare correttamente il significato clinico delle eventuali varianti attraverso l’analisi di segregazione è necessario rendere disponibile il DNA dei genitori contestualmente al probando, laddove possibile.

LIMITE DEL TEST: 

Il test genetico utilizza metodologie di nuova generazione che sono oggi considerate appropriate per una attività diagnostica. Allo stato attuale delle conoscenze i limiti del test sono i seguenti:

– Impossibilita’ di identificare delezioni/inserzioni/duplicazioni genomiche (…)

-Impossibilità di identificare mutazioni somatiche a bassa frequenza nelle cellule di sangue periferico (…)

– Residuale possibilita’ di falsi negativi (…)

– conoscenze ancora parziali del ruolo delle varianti del DNA e delle regioni geniche funzionali

Il test è stato disegnato in base alle attuali evidenze medico-scientifiche. Mutazioni puntiformi non convenzionali e/o in regioni geniche funzionalmente rilevanti ma attualmente non note, potrebbero essere non evidenziate dal test.

(chi fosse interessato al testo completo dell’articolo può contattarci a info@eneaonlus.org)

 

CHIUNQUE FOSSE INTERESSATO A SOTTOPORSI AL TEST GENETICO IN RELAZIONE ALLA POLIMICROGIRIA, PUÒ CONTATTARE IL DOTT. ZARA O LA NOSTRA ASSOCIAZIONE PER ULTERIORI E DETTAGLIATE INFORMAZIONI 

federicozara@ospedale-gaslini.ge.it , info@eneaonlus.org  –   054360420

 

 

 

dott-zaraDott. Federico ZARA: il nostro primo ricercatore

Nato a Napoli da genitori genovesi, è laureato in Biologia con specializzazione in Genetica. Ha vinto una borsa di studio che lo hanno portato a Houston (Texas, USA.) e ha poi lavorato con Telethon come “giovane rientrato dall’estero”; ha lavorato presso l’Ospedale Galliera di Genova nel Laboratorio di Genetica Umana e, dal 2002, è dirigente biologo responsabile del Laboratorio di Patologia Muscolare e Neurogenetica presso l’Istituto G. Gaslini di Genova. Ha partecipato a numerosi progetti europei grazie alla Comunità Europea, Telethon, il Ministero della Salute. Membro della Commissione Genetica della Lega Italiana contro L’Epilessia e dell’International League against Epilepsy, è coordinatore di diversi studi nel campo della genetica delle malattie neurologiche in particolare dell’epilessia.

 

 

dott-zaraProf. Pasquale STRIANO

Pasquale Striano è neurologo pediatria con particolare interesse nelle epilessie. E’ Professore Associato in Pediatria presso l’Università di Genova e svolge la sua attività clinica e di ricerca presso l’Istituto Gaslini. E’ coinvolto attivamente in diversi progetti di ricerca internazionali ed Europei. In particolare, il Dr. Striano è partner associato del consorzio EUROEPINOMICS per lo studio delle epilessie genetiche attraverso tecniche di sequenziamento di nuova generazione e membro del comitato guida del progetto Internazionale Epi25K, che prevede l’analisi genetica di 25.000 persone con epilessia. Nel 2012, gli è stato assegnato il prestigioso ‘Young Investigator Award’ come miglior giovane Europeo per la ricerca sull’epilessia. E’ attualmente Vicepresidente della Società Italiana di Pediatria (SINP) e membro del Consiglio Direttivo della Lega Italiana contro l’Epilessia (LICE). Dal 2013 è Membro del Comitato pediatrico dell’ Agenzia Italiana del Farmaco (AIFA).